Préparations et procédures Pour préparer le spécimen pour l'examen microscopique, l'utilisation d'une méthode standardisée est fortement recommandé
Le spécimen
Le spécimen de choix est la première urine du matin.
Pour l’analyse d’urine complète de routine, le spécimen de choix est la première urine du matin. Ce choix est un compromis, car pour les tests chimiques la première miction est la plus concentrée. Pour la cytologie urinaire, le meilleur spécimen est la deuxième miction du matin (imaginez des cellules après une nuit d'incubation dans de l'urine à 37C).
Le spécimen au hasard est souvent utilisé, c’est d’ailleurs la règle pour l’urgence. Le principal inconvénient provient de la dilution du spécimen. Cette dilution peut être suffisamment élevée pour rendre les décomptes et les tests chimiques faussement négatifs.
Le temps entre le prélèvement et l’analyse.
L’idéal serait que le spécimen soit analysé immédiatement après la miction. Mais soyons réalistes! Il y aura toujours un certain délai entre le prélèvement et l’analyse. Le tout est de fixer des règles pour un délai acceptable et les conditions de conservation.
Quel est le délai acceptable?
Cette question est beaucoup plus facile à poser qu’à répondre. Bien que l’on aime avoir des balises fixes on ne peut répondre catégoriquement, il faut vivre dans ce cas-ci avec un certain flou voir du cas par cas.
Avant de rejeter un spécimen il faut prendre en considération les faits suivants:
- Un spécimen est unique et représente une situation précise. Un autre spécimen est nécessairement obtenu plus tard donc, dans une situation clinique qui risque d’avoir changée.
- Le patient qui se présente à l’hôpital pour des analyses devra revenir en cas de rejet. Espérons que celui-ci ne revient pas uniquement pour un spécimen d’analyse d’urine complète prescrite sans grande conviction.
- Certaines substances peuvent disparaître rapidement, pensons au glucose dans un cas d’infection urinaire. Mais qu’elle était la raison de la demande du clinicien: savoir s’il y a du sucre dans l’urine ou savoir s’il y a infection urinaire?
- Comme pour le sérum, les substances et les éléments n’ont pas tous la même stabilité. Les cellules dégénèrent rapidement tandis que les cylindres se conservent plus facilement.
Les spécimens qui n’ont plus rien à voir avec l’urine lors du prélèvement et qui risquent d’induire en erreur devraient être rejetés. Mais cette situation est un extrême.
Pour plusieurs raisons, nous pensons que tous les spécimens devraient être analysés mais contenir, au besoin, une mention du genre « délai inacceptable: plusieurs des résultats risquent d’être sans valeur ».
La qualité d’un spécimen qui ne peut être analysé rapidement est dépendante de la façon dont on a conservé le spécimen. Plusieurs centres recommandent que les spécimens, qui ne peuvent être acheminés au labo dans un court délai, soient conservés au réfrigérateur. Un inconvénient majeur de cette pratique est la précipitation de cristaux comme les urates amorphes facilement reconnaissables par le culot rose. Dans certains cas, la précipitation est abondante et empêche la microscopie. Une façon simple de se débarrasser de ces urates précipités est de placer le spécimen complet non centrifugé à 37°C (avec le culot, il est souvent impossible de redissoudre le précipité dans un si petit volume). Dans le cas où le précipité serait formé de phosphates amorphes ceux-ci peuvent être dissous par une incubation à 37°C ou par l’addition d’acide acétique 2% au culot à raison de 1 à 2 gouttes.
L’utilisation de bactériostatiques séchés sur la paroi du contenant serait un atout, spécialement pour les spécimens qui doivent voyager.
Le volume
Le volume recommandé est 12 ml. La majorité des centres hospitaliers reçoivent les spécimens pour l’analyse d’urine complète dans des tubes coniques jaugés.
Dans certains cas il est impossible de remplir le tube jusqu’au trait de 12 ml. Haber recommande de compléter le volume à 12 ml avec de la saline isotonique avant la centrifugation et de corriger le résultat selon la dilution. Doit-on rapporter une microscopie corrigée pour le volume ou inscrire au rapport « résultats obtenus avec un spécimen de x ml »? Nous préférons la deuxième solution car il n’est pas évident qu’un enfant en infection urinaire qui fournit un gros 6 ml aurait eu 2 fois plus de leucocytes et d’érythrocytes si le volume de 12 ml avait été respecté. Cette solution laisse au clinicien le soin de corriger, au besoin.
La centrifugation
Il est recommandé de centrifuger 5 minutes à 400 RCF. Le terme RCF qui signifie « relative centrifugal force » dépend du carré de la vitesse de rotation et du rayon de la tête. Dans les manuels d’instructions des centrifuges on retrouve un nomogramme qui permet le calcul de la vitesse de rotation nécessaire pour obtenir un RCF de 400. Avec une tête standard une vitesse d’environ 1200 tours/minute est représentative.
Il ne faut pas trop centrifuger les spécimens car, les culots ont tendance à être trop compacts ce qui nui à la resuspension et de plus; les leucocytes ont tendance à former des amas.
La décantation
Le moyen le plus efficace pour décanter est de procéder par l’aspiration du surnageant. Il est relativement facile de se construire un montage d’aspiration avec une trompe à eau.
Certains recommandent de laisser un volume résiduel de 1,0 ml ce qui fait une concentration des éléments par un facteur de 12.
Nous pensons qu’un facteur de concentration de 20 ( volume résiduel de 0,6 ml) est préférable. Ce choix augmente la probabilité de trouver certains éléments présents en petit nombre comme les cylindres érythrocytaires. Si le culot est trop chargé, il est toujours possible de diluer celui-ci avec une saline isotonique.
La resuspension du culot
Il est fréquent d’avoir au microscope une distribution inégale des éléments. Ceci est spécialement vrai pour les leucocytes. La resuspension inadéquate peut en être la cause mais, la présence de mucus, sur lequel adhèrent les éléments, peut causer une variation significative du décompte selon les champs. L’examen d’une dizaine de champs est, dans la majorité des cas, suffisant pour obtenir une moyenne représentative. La resuspension doit fournir un culot le plus homogène possible. L’utilisation d’un vortex à bas régime est recommandée. Celui-ci n’endommage pas les éléments.
L’étalement
Il est recommandé d’utiliser un volume constant de culot pour l’examen microscopique. Certaines compagnies (Kova et autres) proposent des lames de plastique acrylique calibrées pour contenir toujours le même volume. Ces montages permettent l'utilisation de la lumière polarisée et l'examen avec l'objectif 40x
Pour ceux qui préfèrent utiliser les lames et lamelles de verre le meilleur moyen pour étaler un volume constant est d’utiliser une pipette SMI*. Le volume à utiliser dépend de la grandeur de la lamelle. Pour une lamelle de 22x22 un volume de 20 ul donne le meilleur résultat. L’étalement est, avec ce volume, ni trop épais ni trop mince.
Le rapport
Le rapport de la microscopie de routine qui apparaît au dossier du patient devrait être concis et clair. Il faut éviter à tout prix les listes trop lourdes. Pour les éléments de routine, il est préférable d’utiliser des grilles où le résultat se résume à une marque dans la bonne case. Ce genre de rapport est plus facile à lire.
Le décompte des cellules se fait avec l’objectif 40x tandis que les cylindres sont évalués avec l’objectif 10x. Avec un oculaire de 10x les grossissements sont de 400x et de 100x.
Statland recommande l'utilisation d'une échelle unique pour la numération des éléments. L'échelle proposée a peu de classes et utilise une graduation croissante. ( 0-2, 3-5, 6-10, 11-20, 21-100, >100). Les échelles de ce type sont pratiques et conviennent parfaitement à l'utilisation des systèmes informatiques comme le Clinicom de Bayer.
Les valeurs de référence
Il est difficile d’établir des valeurs de référence pour la microscopie de routine sur une miction. Cependant on peut faire des projections à partir des valeurs obtenues par d’autres méthodes comme; le décompte d’Addis et la technique de cytodiagnostic de Schumann.
Addis, avec une conserve de 12 heures, a établi les valeurs suivantes: leucocytes < 1 000 000, érythrocytes < 500 000 , cylindres hyalins < 5 000.
Schumann a établi les valeurs suivantes pour une microscopie de routine.
L’organisation de l'examen microscopique
Une des difficultés de l'analyse microscopique de l'urine en routine est le nombre d'échantillons à examiner. Certains ont des critères de sélection basés sur l'aspect de l'urine et des réactions de certaines zones du bâtonnet. Cette opération permet d'éliminer de 40- à 60% des spécimens dépendant de la clientèle et des cliniques spécialisées. Même après une première sélection, il reste beaucoup de spécimens que l'on peut classer comme banals. Avec cette masse de spécimens, il est difficile devant un cas important, de mettre tout le temps nécessaire pour faire un bon travail et surtout de faire abstraction des cinquante spécimens encore à faire. Pour palier à cette situation, nous avons proposé d'échelonner l'analyse microscopique en trois phases.
Phase I
La première phase est une étape de dépistage des cas spéciaux et de la numération de base des cellules et des autres éléments du sédiment. Celle-ci se fait rapidement et, à la fin de cette étape, le spécimen est soit transmis ou sélectionné pour une deuxième phase, selon certains critères illustrés.Algorithme de l'analyse de routine phase I
Phase II
La deuxième phase est un examen plus poussé avec, au besoin, des colorations spéciales pour bien identifier tous les éléments significatifs qui forment l'image du type de sédiment. Encore une fois, nous utilisons des critères qui, lorsqu'ils sont positifs, entraînent une recherche spécifique. Nous avons remarqué que ce système était plus efficace si cette phase était exécutée à la fin de toutes les analyses de la phase I, ou par une autre personne. Il s'agit ici d'une question d'organisation de la section.
Phase III
La troisième phase est l'appel à des ressources supplémentaires comme le département de cytologie, par exemple. Pour Schumann , cette étape est la base de sa méthode de cytodiagnostic. Les spécimens ayant besoin d'un examen plus important sont colorés avec la coloration de PAP et examinés selon les critères de la méthode.